Home / Sanatate / INTERVIU cu prof. dr. Adrian Man. În culisele prelucrării RT-PCR a testelor COVID-19

INTERVIU cu prof. dr. Adrian Man. În culisele prelucrării RT-PCR a testelor COVID-19

Sunt din ce în ce mai multe cazuri pozitive de infecție cu SARS-CoV-2 în județul Mureș, numărul probelor zilnice ce ajung să fie prelucrate în cadrul laboratorului Spitalului Clinic Județean Mureș fiind deja de ordinul sutelor, mult peste capacitatea declarată. O mână de oameni manipulează zi de zi probele de SARS-CoV-2, în condiții riguroase de lucru deoarece șansele de contaminare sunt mari, și le pregătesc pentru testarea Real Time PCR. Într-un interviu acordat cotidianului Zi de Zi, Prof. Dr. Adrian Man, microbiolog, medic primar medicină de laborator, șeful Laboratorului de Analize Medicale a Spitalului Clinic Județean Mureș, a explicat ce se întâmplă în ”culise”, cum se prelucrează proba pentru identificarea SARS-CoV-2, care sunt riscurile, de ce pot să apară rezultate fals pozitive sau fals negative, în ce măsură influențează sensibilitatea și specificitatea sistemului RT-PCR rezultatul testului COVID-19, dar și în ce măsură ar fi indicate testele rapide.

Reporter Sănătate, Zi de Zi: Cum arată o zi de rutină în prima linie a diagnosticului de COVID-19? Care considerați că este cea mai mare provocare în ”culisele” testelor pentru SARS-CoV-2?

Prof. Dr. Adrian Man, șeful Laboratorului de Analize Medicale a Spitalului Clinic Județean Mureș: Rutina începe dimineața, de la ora 8.00, din momentul în care primim probele din teritoriu: din spitalul nostru, cele furnizate de Direcția de Sănătate Publică Mureș și cele de la spitalele arondate. Procesul de lucru este destul de stufos în sensul că fiind foarte multe probe, ele trebuie sortate și sortarea este făcută de către personalul disponibil, începând de la asistentă, registratoare, medic. Această etapă se efectuează într-o cameră bine izolată, din zona roșie, special dedicată prelucrării probelor. Probele pacienților se sortează după lista de lucru din laborator. Fiind zeci și chiar sute de probe, zilnic, procesul durează. În paralel sunt și fișele de însoțire ale probelor pacienților, care trebuie sortate, scanate, introduse în sistemul electronic al spitalului. Toată această parte de pregătire durează cam trei ore-trei ore și jumătate. Între timp, o altă parte din echipă, aflată în laborator, pregătește echipamentele, recipientele pentru prelucrarea probelor. Și aici este un protocol de lucru foarte bine stabilit, în condiții foarte riguroase de lucru, pentru că există șanse de contaminare a probelor între ele. Bineînțeles că noi, în laborator, cunoaștem acest fapt și ne luăm toate măsurile necesare ca să prevenim acest lucru. Sunt două variante, fie să se contamineze probele între ele și atunci bineînțeles că vor ieși pozitive sau sunt șanse de prelucrare incorectă a produsului și erori de lucru și astfel probele să iasă negative. Acest lucru nu s-a întâmplat niciodată și sperăm să nici nu se întâmple pentru că noi avem măsuri de control încrucișat și astfel ne putem da seama dacă sunt astfel de probleme. Dacă ar apărea, bineînțeles că se va repeta proba. În niciun caz nu se dă un rezultat eronat din această cauză.

M-ați întrebat de provocări. Acestea sunt legate foarte mult de limitările tehnice și de resurse umane, pentru că biologia moleculară este o categorie de analiză de laborator puțin diferită față de analizele de rutină, cum sunt spre exemplu hemoleucograma, analizele biochimice, care nu necesită atât de multe măsuri stricte. În procesul de amplificare genică, din câteva molecule de acid nucleic, aparținând virusului, se produc milioane de copii de acid nucleic, care nu sunt infecțioase, pentru personal nu reprezintă pericol, dar pericol ar fi dacă acestea ajung în mediul lucru. Atunci acesta fiind contaminat există riscul să cross-contamineze alte probe și să apară rezultate false. Din acest motiv, circuitul de laborator în biologie moleculară este foarte strict. Pentru că resursa umană și echipamentele sunt limitate respectarea strictă a acestor circuite duce la prelungirea procesului de lucru.

Noi am declarat o capacitate a laboratorului în care putem asigura probele în cursul programului nostru de lucru. Dar dacă sunt probe mai multe și trebuie deservite, pentru că în situația actuală nu prea avem ce face, ne împărțim, facem ture, mai stăm peste program. Eforturile fizice și psihice sunt foarte mari.

Rep.: Care este capacitatea pe care o puteți asigura și câte probe prelucrați în perioada aceasta?

A.M.: La început, în luna aprilie, când am debutat cu laboratorul nostru, am început cu 20-30 de probe pe zi, cele din Spitalul Clinic Județean Mureș. Încet, încet a crescut numărul de probe, am început să primim și din partea DSP-ului care culege probe din multe părți și mai nou primim și de la spitalele din Târnăveni, Luduș. O capacitate reală, ca să lucrăm lejer, ar fi în jur de 90 de probe pe zi. Dar facem și mai mult, peste 200.

Rep.: Care este norma de personal ce asigură prelucrarea acestor probe?

A.M.: Acum suntem trei medici, un biolog, o asistentă permanentă pe biologie moleculară și două asistente din laboratorul Clinicii de Boli Infecțioase, care vin și ne ajută.

Rep.: La nivelul decidenților se discută de necesitatea de a se dubla capacitatea de testare la nivel național. Ați face față în acest caz?

A.M.: Nu dacă s-ar dubla așa, de la o zi la alta. Și dacă am primi personal suntem limitați de infrastructură, pentru că momentan toate extracțiile de acizi nucleici, de ARN viral, le facem manual. Încă nu am primit extractor automat și chiar dacă l-am primi ar trebui unul de capacitate mare, de minim 96 de prelucrări în paralel ca să putem face 2-3 runde de extracții și de amplificări pe zi. Într-o rundă intră 94 de probe deoarece pe fiecare placă de amplificare se pun și controalele de reacție, controale negative și pozitive.

Rep.: Cum decurge prelucrarea unui test COVID, de la momentul recoltării și până la eliberarea rezultatului? Care sunt etapele? Este suficient să fie pusă proba în aparatul PCR și el să își facă treaba și să dea rezultatul sau este nevoie și de resursa umană pentru interpretarea  rezultatului?

A.M.: Aparatul face ce-i dăm de făcut și dă un rezultat. Asta știe să facă singur. Problemele sunt altundeva, ce-i dăm de lucru și cum interpretăm rezultatul dat de aparat? Și aici probabil că sunt foarte multe deficiențe în modul de trimitere și prelucrare a probelor. Sunt multe elemente în acest flux. Se începe cu proba pacientului. Dacă ea nu este recoltată corect deja avem un factor care duce la rezultat fals negativ, în mare parte. Să ne gândim la o variantă în care acele bețișoare care sunt introduse prin cavitatea nazală și cavitatea bucală nu recoltează secreția, adică se introduc și nu recoltează nimic, ele sunt goale. Rezultatul va fi negativ din cauză că nu s-a recoltat corect. Nu ar trebui să se întâmple acest lucru pentru că personalul a fost instruit cum să recolteze.

Intră proba în laborator, urmează etapa de extracție a acizilor nucleici virali. Aici sunt două variante: fie prin metode manuale, fie automate. Esența este aceeași, doar că extracția automată este mult mai rapidă și o face aparatul în loc să lucreze resursa umană. Aici este o etapă foarte riguroasă în sensul că presupune o serie de pipetări, de centrifugări ale probelor. Este o metodă ce durează mult dacă sunt multe probe. Urmează partea de amplificare genică, care este etapa în care produsul obținut din extracție intră la amplificare. Ce se întâmplă aici de fapt? Când facem extracția de acid nucleic din secreția nazală a persoanei respective se extrage acid nucleic total, adică ADN, ARN din celule, din alte virusuri, bacterii care sunt în organismul nostru. Printre acești acizi nucleici totali extrași, dacă este prezent și virusul SARS-CoV-2, vor fi și bucățele de acid nucleic viral ale acestuia. Ele trebuie recunoscute, iar această recunoaștere se face prin amplificarea genică RT-PCR, care este ultima etapă de prelucrare. RT-PCR înseamnă Revers Transcriptase Polymerase Chain Reaction, adică prin revers-transcripție ARN-ul viral este transformat în ADN viral, un fel de copie ce poate fi multiplicată de foarte multe ori. Recunoașterea acidului nucleic viral se face foarte specific pentru că reactivii care intră în reacția RT-PCR sunt astfel creați încât să multiplice doar acea secvență virală, doar dacă este prezentă. Dacă nu există secvență virală în proba pacientului, nu se amplifică nimic, iar rezultatul va fi negativ. Aici deja ne putem gândi la acea șansă de contaminare, dacă câteva molecule de acid nucleic viral pătrund în probă din altă parte atunci ele se vor multiplica iar aparatul va da semnal pozitiv. Păstrând regulile foarte riguroase de extracție de acizi nucleici, de amplificare, evităm practic aceste contaminări.

Aparatul are o funcție specială prin care recunoaște dacă s-a amplificat ceva sau nu și amplificarea o vedem în timp real prin așa numita curbă de amplificare, este o curbă sinusoidală. Dacă doza de ARN viral din proba pacientului este foarte mare, adică pacientul este în stadiu acut de boală, amplificarea se va face foarte repede, sunt suficiente câteva cicluri de amplificare astfel încât să avem suficient material amplificat care să fie detectat de aparat. Dacă pacientul are viremie mică, adică este fie la început de boală fie la sfârșit de boală, atunci acea cantitate mică de ARN va fi detectată, dar după mai multe cicluri de amplificare, curba va apărea mult mai târziu, dar tot un rezultat pozitiv este. Prin natura testelor comerciale existente, se eliberează rezultate calitative, adică pozitiv sau negativ.

Sunt situații în care multe dintre aceste kituri de detecție caută minim 3 gene virale, nu numai una. Dacă din cele trei gene doar o singură genă este detectată și probabil nici curba de amplificare nu este cea mai sugestivă pentru o amplificare reală atunci răspunsul este undeva la mijloc, adică ori este foarte puțin virus, dar nu sunt convins că este pozitiv în mod real și nu sunt convins nici că este total negativ, de obicei eliberăm rezultat incert și recomandăm repetarea probei. Este cea mai bună procedură ca să nu dăm rezultate false. Dintr-o baterie de teste zilnice sunt poate 3-4 probe incerte.

Reporter: După ce sunt obținute rezultatele, materialul preluat din probe este înghețat, stocat? Pe ce perioadă?

Prof. Dr. Adrian Man, șeful Laboratorului de Analize Medicale a Spitalului Clinic Județean Mureș: ARN-urile extrase de la probele pozitive le congelăm și le menținem în banca de ARN-uri, nu știu încă pe ce perioadă deocamdată, dar se adună deja multe. Fiind o boală cu multe necunoscute, în curs de cunoaștere, este bine să avem banca de ARN-uri și pentru studii ulterioare, dar și pentru verificarea unei probe, dacă există vreo incertitudine și se solicită verificarea.

Rep.: Se vorbește mult despre sensibilitatea și specificitatea testului COVID-19. Vă rog să explicați în ce constau acestea și cum influențează ele rezultatul final.

A.M.: Sensibilitatea se referă la cât de mare este șansa de a găsi acidul nucleic viral dintr-o probă, dacă acela este prezent, într-adevăr. Testul de RT-PCR are o sensibilitate apropiată de 100%, asta derivă din metoda în sine, care amplifică materialul genetic de foarte multe ori, exponențial. Practic, numărul de molecule se dublează după fiecare ciclu de reacție. Să ne gândim că avem o moleculă de acid nucleic, componentă a unui virus – după 40 de amplificări, calculați 2 la puterea 40, rezultă un număr cu multe zerouri.  Deci sensibilitatea este enormă. Kiturile noastre de detecție detectează minim 5 molecule de ARN din proba pacientului. Dacă 5 virusuri sunt prezente în probă semnalul va fi pozitiv, deci sensibilitatea este extrem de mare. La metodele PCR specificitatea este iarăși apropiată de 100%. Specificitatea înseamnă că ceea ce caută aparatul este într-adevăr obiectul sau ceea ce căutăm noi. Nu dă reacții încrucișate cu alte molecule de ARN de la alte virusuri, de la bacterii. Este o reacție foarte specifică. Acest lucru nu are numai avantaje, ci și dezavantaje. Spre exemplu, sunt foarte multe studii care spun că pacienții care au trecut prin boală mai au virus persistent în corp, dar nu mai este infecțios, nu mai are capacitate să se replice, nu se mai transmite, nu mai produce boală, dar informația genetică este în celule încă o perioadă de timp, ce variază, două, trei săptămâni, o lună și aparatul o găsește.

Rep.: Așa se explică spitalizările pe o perioadă îndelungată care au avut loc în primăvară.

A.M.: Da, au fost persoane care au stat trei luni în spital, nu mai aveau niciun semn de boală, nu mai erau nici contagioși. Acum știm, dar la ora aceea nu știam (faptul că după o perioadă pacientul nu mai este contagios, dar în organism mai are informație genetică a virusului ce este detectată de aparatul RT-PCR – n.r.). De aceea există regula ca după două săptămâni persoana să poată fi integrată în societate.

Rep.: Dată fiind această sensibilitate și specificitate în cazul testelor RT-PCR, utilizarea testelor rapide cât este de indicată pentru aflarea unui rezultat cert?

A.M.: La orice boală infecțioasă PCR-ul, în general, reprezintă o metodă de confirmare a bolii, prin sensibilitatea și specificitatea crescută. De foarte multe ori nu este o metodă de diagnostic de primă intenție, pentru că este scumpă, laborioasă și ar trebui să fie rezervată doar în situațiile în care aplicând un test de altă natură, un test rapid, de exemplu, acesta dă un rezultat care nu este concludent. Adică dacă există dubii clinice, epidemiologice, că nu este chiar corect rezultatul testului rapid, atunci confirmăm sau infirmăm rezultatul cu metoda PCR. Așa se procedează la multe alte tipuri de boli. Bineînțeles, acum fiind un virus nou testele rapide nu sunt așa de bine puse la punct și încă sunt rezerve. De exemplu testele de anticorpi sunt demult pe piață, dar multe studii nu au găsit nicio corelație între evoluția unei boli și detectarea anticorpilor prin testele rapide, pentru că răspunsul nostru imun față de virus este încă necunoscut. Sunt persoane care au boală simptomatică și nu au anticorpi sau sunt persoane care au avut boală, nici nu știu, nu au avut simptome și au anticorpi. Logica spune că o persoană care a trecut printr-o boală infecțioasă va dezvolta anticorpi împotriva acelui virus.

Rep.: Când vorbim de o doză infectantă care să determine apariția bolii? Este suficient să trecem pe lângă o persoană infectată care strănută, să inhalăm picăturile expulzate și este suficient ca virusul odată ajuns în cavitatea nazală/bucală să se replice?

A.M.: Este foarte greu de spus, aici sunt încă foarte multe necunoscute. Dacă ne gândim în general la orice virus respirator, în principiu el trebuie să fie contactat, apoi să se atașeze de mucoasa țintă, respectiv mucoasa respiratorie, după care să intre în celule și să apuce să se replice. În toată această poveste este o balanță între imunitatea noastră și capacitatea de infecție a virusului. Dacă brațele balanței se înclină atunci avem o problemă, adică dacă este o tulpină foarte virulentă de virus, el poate să treacă de capacitatea noastră imună foarte rapid și ne îmbolnăvește instant. De cealaltă parte, dacă imunitatea noastră suferă din diferite motive, poate este suficientă o doză foarte mică pentru a iniția infecția. Dacă balanța este echilibrată posibil ca, chiar dacă contactăm câteva particule virale, imunitatea noastră înnăscută, nespecifică, ar putea să țină sub control virusul și să nu-l lase să pătrundă și să inițieze infecția. Dar în SARS-CoV-2 încă avem necunoscute privind acest lucru, deci rămâne de văzut probabil în următoarele luni, următorii ani, care este povestea reală. Încă nu putem știi care este doza infectantă. După părerea mea, nu este suficient să treacă printr-un spațiu o persoană una pe lângă alta și să contacteze virusul și să facă boală.

Material realizat, în cadrul rubricii ”Ghidați-vă după Zi de Zi”, cu sprijinul grantului Google despre care mai multe detalii găsiți aici – https://newsinitiative.withgoogle.com/journalism-emergency-relief-fund

A consemnat Arina TOTH

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *

DISCLAIMER
Atentie! Postati pe propria raspundere! Inainte de a posta, cititi aici regulamentul: Termeni legali si Conditii

Regulile de preluare a articolelor

Acest articol este proprietatea Cotidianului Zi de Zi și este protejat de legea drepturilor de autor. Orice preluare a conținutului se poate face doar în limita a 500 de semne, cu citarea sursei și cu link către pagina acestui articol.

De asemenea, verificati

Comunicat de presă – Extindere și reabilitare școală gimnazială în localitatea Gănești

60 SHARES Distribuie pe Facebook Tweet Follow us Share Share Share Share Share